分析方法验证的经验

常规检测中需验证的分析项目主要有：鉴别试验，杂质定量检查或限度检查，有效成分含量测定，以及其他成分（如防腐剂等）的测定等。药典规定验证的内容有：专属性、检测限、定量限、准确度、精密度（包括重复性、中间精密度和重现性）、线性和范围、耐用性。在实验中视具体方法拟订验证的内容。附表中列出的分析项目和相应的验证内容可供参考。方法验证内容如下。
一、准确度
准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率（%）表示。准确度应在规定的范围内测试。案例：有关物质回收率

二、精密度
对于含量测定和杂质的定量测定一般应考虑方法的精密度。
三、专属性
       专属性系指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在下，采用的方法能正确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检查、含量测定方法均应考察其专属性。如方法不够专属，应采用多个方法予以补充。
1．鉴别反应
应能与可能共存的物质或结构相似化合物区分。不含被测成分的样品，以及结构相似或组分中的有关化合物，应均呈负反应（不呈正反应）。
2．含量测定和杂质测定
    色谱法和其他分离方法，应附代表性图谱，以说明方法的专属性，并应标明诸成分在图中的位置。色谱法中的分离度应符合要求。
    在杂质可获得的情况下，对于含量测定，试样中可加入杂质，考察测定结果是否受干扰，并可与未加杂质的试样比较测定结果。对于杂质测定也可向试样中加入一定量的杂质，考察杂质能否得到分离。
    在杂质或降解产物不能获得的情况下，可将含有杂质或降解产物的试样进行测定，与另一个经验证了的或药典方法比较结果。用强光照射，高温，高湿，酸、碱水解或氧化的方法进行加速破坏，以研究可能的降解产物和降解途径。含量测定方法应比对二个方法的结果，杂质检查应比对检出的杂质个数，必要时可采用二管阵列检测和质谱检测，进行峰纯度检查。
四、检测限
    检测限系指样品中被测物能被检测出的低量。药品的鉴别试验和杂质检查方法，均应通过测试确定方法的检测限。常用的方法如下。
1．非仪器分析目视法
用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的低浓度或量。
2．信噪比法
用于能显示基线噪声的分析方法，即把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的低浓度或量。一般以信噪比为3∶1或2∶1时相应浓度或注入仪器的量确定检测限。
3．数据要求
应附测试图谱，说明测试过程和检测限结果。
五、定量限
    定量限系指样品中被测物能被定量测定的低量，其测定结果应具有一定的准确度和精密度。杂质和降解产物用定量测定方法研究时，应确定方法的定量限。
常用信噪比法确定定量限。一般以信噪比为10∶1时相应浓度或注入仪器的量确定定量限。例：定量限检测结果
六、线性与范围
应在规定的范围内测定线性关系。可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列供试样品的方法进行测定，少制备5份供试样品。以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图，观察是否呈线性，再用小二乘法进行线性回归。必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算。
七、耐用性
       耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为把方法用于常规检验提供依据。开始研究分析方法时就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻，则应在方法中写明。典型的变动因素有：被测溶液的稳定性，样品的提取次数、时间等。液相色谱法中典型的变动因素有：流动相的组成和pH值，不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱，柱温，流速等。气相色谱法变动因素有：不同厂牌或批号的色谱柱、固定相，不同类型的担体，柱温，进样口和检测器温度等。
案例：有关物质检查HPLC方法的耐用性